黄瓜上甜瓜黄斑病毒的初步鉴定及序列分析

在山东省寿光市黄瓜保护地种植区采集到疑似感染甜瓜黄斑病毒的黄瓜病叶，采用反转录·聚合酶链反应对其进行检测，结果显示目的片段的大小为505碱基对，与预期结果一致；序列同源性比对分析结果表明，黄瓜上甜瓜黄斑病毒寿光分离物与中国三亚的甜瓜黄斑病毒分离物和中国台湾的甜瓜黄斑病毒亲缘关系较近，同源性可达到98%。

甜瓜黄斑病毒是布尼亚病毒科番茄斑萎病毒属的成员，主要通过蓟马以持久增殖方式传播，其主要寄主为甜瓜、西瓜、黄瓜及苦瓜等葫芦科作物。甜瓜黄斑病毒具有与其他番茄斑萎病毒属相同的分子结构，包括3个单链线性RNA片段，其中SRNA含有2个开放阅读框架，分别编码核壳体蛋白和非结构蛋白。

甜瓜黄斑病毒于2000年最早发现于日本，Chen等（2008）在我国台湾西瓜上首次发现甜瓜黄斑病毒，2009年古勤生等（2011）报道在海南三亚甜瓜上首次发现该病毒，其与日本和中国台湾分离物氨基酸序列同源性均达到99%以上，随后在台湾的黄瓜（Chapetal.，2010）和甜瓜（Pengetal.，2011）上相继发现甜瓜黄斑病毒。目前，泰国、印度等地都有在不同作物上检测到甜瓜黄斑病毒的相关报道。本研究将以采取的疑似感染甜瓜黄斑病毒的黄瓜病叶为试材，采用反转录·聚合酶链反应方法进行初步鉴定和序列分析，以期为该病毒的早期预警提供技术支持。

甜瓜黄斑病毒侵染黄瓜后表现的症状主要为叶片出现大量褪绿斑点，严重时邻近斑点融合形成大的坏死斑点，叶片变黄，随后植株叶片呈现黄色坏死斑，导致果实品质下降，风味变差，商品性基本丧失。

在山东省寿光市的黄瓜种植区，采集到具有典型症状的黄瓜病叶10份，保存于-80℃备用；病毒的阳性对照和健康对照（黄瓜叶片）。采用甜瓜黄斑病毒的特异性引物对黄瓜病样进行反转录·聚合酶链反应扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测可知，感病样品的扩增产物大小约在500碱基对，与阳性对照的检测结果相同；而健康植株无任何条带，与预期结果一致。

将得到的聚合酶链式反应产物纯化后克隆到pEASY-T1Simple载体，对含有目的片段的重组子进行序列测定，结果表明甜瓜黄斑病毒寿光分离物的扩增产物由505个核苷酸组成，这与已报道的文献序列相吻合。

对采集的10份黄瓜样品按照上述方法分别进行检测，结果显示8个样品为阳性，其余为阴性，可见反转录·聚合酶链反应检测甜瓜黄斑病毒有较高的准确性和稳定性。

甜瓜黄斑病毒是近几年才发现的一种瓜类病毒病，寄主范围比较狭窄，根据目前报道主要集中在甜瓜等葫芦科作物，古勤生等（2011）在海南三亚保护地发现甜瓜的发病率为30%-100%，造成了严重的经济损失；而在山东寿光保护地的黄瓜发病率仅为10%左右，这或许与瓜农的种植模式和气候等因素有关。虽然目前该病毒在我国北方地区的发生程度并不严重，但鉴于番茄斑萎病毒属的其他病毒，如番茄斑萎病毒、凤仙花坏死斑病毒、辣椒褪绿病毒对花卉、辣椒等多种作物的危害，针对甜瓜黄斑病毒的监测和防控不容忽视，应及时建立甜瓜黄斑病毒早期快速检测技术。

由于甜瓜黄斑病毒对甜瓜、黄瓜等葫芦科的作物危害较大，在瓜类密集种植区应对其发病时间、范围等进行长期跟踪调查和检测。我们将以本研究为基础，进一步确认该病害各时期的症状特点及发生规律，适时引入ELISA等血清学监测检测新技术，进一步提高对该病害的野外跟踪监控能力。

通过同源性比对分析发现，甜瓜黄斑病毒寿光黄瓜分离物与古勤生等（2011）报道的三亚甜瓜分离物及中国台湾西瓜分离物的同源性都较高，可以推测为同一种病毒；其与印度和日本的黄瓜分离物的同源性也较高，这说明同为黄瓜分离物并未受地缘关系的影响，具有很近的亲缘关系；而同为甜瓜分离物的同源性差异较大，其中泰国3个、日本1个和中国广州分离物属于同一分支，与中国的三亚分离物处于不同分支，这又充分表明甜瓜黄斑病毒各分离物的亲缘关系与地理位置并无直接联系，与陈红运等（2012）的研究结果基本一致。因此，正确理清当地甜瓜黄斑病毒分离株的分子结构和基因变异程度，为该病害的流行性分析及抗病育种奠定坚实的理论基础。

（注：原文内容有删减）

乔宁 王兴翠 田素波 刘永光 姜会霞 李美芹 竺晓平